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6；寻找颈静脉。
7；在颈静脉处剪毛，术部用酒精棉球消毒。
8；左手按住颈静脉的术部向心端；右手将16号针头垂直或沿颈静脉走向斜向刺入颈静脉；调整针头插入深度使静脉血从针头流出；立即用消毒试管收集流出的血液，在采血的过程中，左手始终要按紧颈静脉的术部向心端；扎针时要看清突起的血管，果断用力，力求一针见血。
9；每头牛采3…5ml血液，送开左手后；右手拔出针头；用酒精棉球消毒术部，在收集血液的试管上标记上相应的牛号。将采有血液的试管斜放，待凝固后，带回实验室分离血清，以便进行布氏杆菌凝集实验。
结核菌素点眼试验（操作示范）
（1） 保定牛。
（2） 仔细检查牛眼睛，发炎者不能做点眼试验。
（3） 用左手拇指和食指将牛眼的上、下眼睑分别向上、下翻张使眼结膜囊暴露，右手用1％硼酸棉球擦去眼周围活物。
（4） 右手用滴管将结核菌素…5滴滴入眼结膜内，滴管头不要接触眼结膜。
（二） 第二次实验（地址：牛场）
1 ，变态反应皮内实验。必须在第一次注射结核菌素后，分别在７２小时和第１２０小时观察注射局部的反应情况。主要是观察有无炎症反应；并测量皮皱厚度和肿胀面积的大小，据此判定试验结果，对第72小时观察，反应呈阴性或可疑的牛只须立即在第一次注射的同一部位，以同一剂量进行第二次注射，剂量同第一次。第二次注射后48小时（即第一次注射后第120小时）应在观察一次。观察情况均有详细记录。
变态反应点眼实验 应于点眼后3；6；9小时各观察一次；并作好记录，必要时可观察第24小时的反应；观察时可作翻眼检查
（三）分离血清步骤
１、 将试管中凝固的的血清检样，2000转/分离心15分钟。
２、 将血凝块上的血清用滴管吸至另一空的消毒试管中，然后将原试管上的牛号标签贴至血清的试管上。
３、 如果离心后仍无血清析出，可用干净铁丝插入管底，沿管壁移动铁丝使血凝块与试管分离，再离心，并重得步骤2。
４、 血清置4℃冰箱保存，72小时内作布氏杆菌试管凝集试验。
（四）布氏杆菌试管凝集试验
１、 操作方法表解如下：
试管号 1 2 3 4 5 6 7
稀释倍数 1：25 1：50 1：100 1：200 1：400 阳性对照 阴性对照
试
液
0。5％石炭酸生理盐水 2。4
0。1
0。5 0。5
0。5 0。5
0。5 0。5
0。5 布氏杆菌阳性诊断血清（1：100）
0。5ml
弃0。5ml 布氏杆菌阴性诊断血清（1：100）。
0。5ml
布氏杆菌诊断Ag（1：20） 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5
充分振荡；混匀；37℃温箱24小时；观察结果
２、 比浊管制备
3。5％石炭酸生理盐水
布氏杆菌诊断Ag液（1：10）
清朗度
标记
1。0
0。75
0。5
0。25
0。0
0。6
0。25
0。5
0。75
1。0 100％
75％
50％
25&
0。0％ ＋＋＋＋
＋＋＋
＋＋
＋
…
３、 判定结果并记录
四、思考题
１、 本试验中，如何观察结果？确定为结核杆菌或布氏杆菌病阳性、可疑的标准各是什么？对阳性或可疑牛应如何处理？
２、 犊牛变态反应皮内法的试验部位是什么？注射剂量是多少？羊布氏杆菌凝集试验用什么稀释度？
３、 家畜布氏杆菌的诊断方法有哪几种？其优点各是什么？
４、 在进行牛结核病菌 变态反应诊断时，什么情况下春用皮内法？在什么情况下需同时用皮内和点眼两种方法？为什么？
实验四 猪瘟的诊断
I免疫酶组化法
一、 目的
了解免疫酶组化法的一般程序和酶标记技术：
掌握用免疫酶组化法诊断猪瘟的方法。
实验器材
剪子、镊子、100ml染色缸。载玻片、玻片ml试管、滴头、1ml吸管、脱脂棉、吸水纸、擦镜纸、显微镜、橡皮膏、酒精灯、铂耳、1000ml烧杯、铜蓝、搅拌器、磁捧、酒精棉球
500ml量筒、500ml三角烧瓶、大滤斗。
酶标抗体、PH7。2 0。015M PBS、1％NaN2、1％H2O2、Tris_HCL缓冲液、DAB 、4℃丙酮、病猪血液（抗菌素凝血）、病猪脏器、水浴箱。
二、 溶液配制
１、 PH7。6 0。05Mtris_HCL缓冲液：
0。2M Tris（24。24g/l） 250ml
0。1N HCL（8。4ml/L） 375ml
NaCL 7。6g
DW 1000ml
2、0。01％H2O2、NaN2、PH7。6 0。05M Tis…HCL；缓冲液；用作内源酶灭活液：
取PH7。6 0。05M Tris…HCL缓冲液98ml；加1％H2O2 1ml和1％NaN2 ；1ml即成。
3底物液：PH7。6 0。05M Tris…HCL缓冲液100ml加DAB75mg；避光搅拌3小时；使其溶解；滤纸过滤。临用前加工厂％H2O2 0；5ml。
四、 实验动物的准备
用猪瘟自然病例或人工感染猪病料作实验。
人工感染需要在实验前四天用猪瘟强毒（血毒）注射40斤左右的猪瘟易感猪，2ml/只，肌注。猪在3…4天后发病死亡，临死前采猪心脏血，抗凝，以备做白细胞涂片。
解剖猪，采淋巴结、脾、扁桃体，各做组织触片。
五、 实验田步骤
１、 制片
（1） 取试管中抗凝血浆层置另一空试管中3000r/ml15分钟，弃血浆，用生理盐水将试管中的沉积细胞洗一次，最后用0。1…0。3ml生理盐水悬浮沉积细胞；取2铂耳在载玻片上作2个均匀的涂片。自然干燥。
（2） 用脾、肾、淋巴结、扁桃体等脏器中的一种在载片上作两个横切触面，自然干燥。
（3） 对两张片子作正反、左右标记。
２、 固定
将玻片置染色缸中，用4℃丙酮固定10分钟。
３、 灭活内源酶
取内源酶灭活液100ml于待检玻片的染色中，室温灭活30分钟，将玻片取出，流动的PBS洗15分钟，再换去离子水洗10分钟，取出玻片，自然干燥。
４、 酶染
用1mlPBS溶解一支冻干猪瘟标抗体制剂 ，在玻片左边的触（涂）面上滴加2滴猪瘟酶标抗体液并涂开，使其覆盖触（涂）面，右边用PBS覆盖作对照，将玻片平放在玻片上，置37℃45分钟，取出玻片，流动的PBS洗15分钟。
５、 显色
取底物液100ml于放有检样玻片染缸中，置室温。避光，30分钟。取出玻片，流动的去离子水洗15分钟，使其干燥。
６、 镜检
若左边触（涂）面中细胞 浆呈棕黄色，细胞核无色，右边对照不显色者，则为阳性；否则为阴性。
７、 认真观察病变。
II免疫荧光试验
一、 目的
掌握免疫荧光试验的方法及原理。
二、 实验步骤
１、 制片、固定同前法。
２、 加染荧光抗体
在玻片左边的触（涂）面上滴2滴猪瘟荧光抗体液并涂开，右边用PBS作对照，将玻片平放在玻片架上，置37℃45分钟，其后PHS（PH7。4；0。01M）洗15分钟。
３、 晾干玻片后，镜检。若左边触（涂）面中细胞浆呈特异性黄绿色荧光，右边对照不呈色者，则为阳性；否则为阴性。
III、示教实验
１、 ELISA试验检测猪瘟抗；
２、 猪瘟病毒单克隆抗体的诊断应用；
３、 感染猪瘟病毒PK…15细胞的IIF。
IV思考题
１、 为什么要对触（涂）片进行固定？
２、 为什么要灭活内源酶？机理是什么？
３、 免疫酶组化法和常规ELISA有何异同点？优缺点是什么？
４、 诊断猪瘟还可用哪些方法？
实验五 鸡新城疫的诊断
I、 鸡新疫病毒的鸡胚分离
一、 目的
掌握利用鸡胚分离病料中的NDV；
熟悉鸡胚接种方法。
二、 实验器材
碘酒棉球、酒精棉球 锥子 蛋架 10ml灭菌管 1ml 、5ml吸管 玻璃研磨器 1ml注射器 5号针头 9…10龄鸡胚 生理盐水
青霉素双抗液（1万iu/ml） 离心机 天平 剪刀 镊子 玻璃
铅笔 ND病死鸡 透明胶布 照蛋器
三、 实验动物的准备
将NDV强毒做1：100稀释注射健康的NDV易感小鸡（1月龄左右），0。2ml/只胸肌注射；小鸡将在注射后48小时左右死亡。死亡鸡尽快进行实验。
亦可从ND自然病鸡分离病毒。
四、 实验步骤
１、 无菌操作，沿死鸡颅腔边剪开颅骨，用镊子除去头盖骨，使脑髓暴露。
２、 取约1g（蚕豆大小）脑髓置玻璃磨器内，并加少量生理盐水，磨碎，再补加生理盐水使总量约为5ml。然后加入双抗液0。5ml（最终浓度达1000iu/ml），置37℃作用20分钟，离心，2000转/分，15分钟。
３、 取上清液接种鸡胚尿囊腔
（1） 照蛋。在靠近气室的下方，避开大血管，用玻璃铅笔标记接种点。
（2） 消毒。打孔。
（3） 接种：将针头以与蛋壳成30（度）角的方向刺入尿囊腔，向尿囊腔内接种经步骤2处理的病料上清液0。1ml；注射速度宜慢。
（4） 用透明胶布封口。
４、 接种24小时开始照蛋，每天上、下午各照一次，弃去24小时内死亡的鸡胚，24小时以后死亡的鸡胚，置铁篓中，大头朝上，置4…8℃备做HA、HI试验。
５、 观察死亡鸡的病变并做记录。
II、 免疫荧光试验
一、 目的
了解免疫技术的一般程序和荧光抗体的制备；
掌握利用抗NDV单克隆抗体和间接免疫荧光技术诊断ND的方法。
二、 实验器材
抗NDV单抗 兔抗鼠荧光抗体 PH7。2 0。01MPBS 铜蓝 丙酮 蒸馏水 载玻片（洁净无油） 1000ml烧杯 磁棒 磁力搅拌器
滴管 吸水纸 剪刀 外科手术刀 镊子 病死鸡（新鲜）
三、 实验动物的准备
同实验I
四、 实验步骤
１、 无菌操作，解剖鸡。
２、 取脑、肺、脾和盲肠扁桃体，用切面在载玻片上作两个很薄的压印，自然干燥。
３、 压印片置盛有4℃丙酮的染色缸内固定10分钟，取出自然蒸发干燥。
４、 压印片置染色架上，一个压印面上加NDV单抗液数滴覆盖，另一个压印面上加PBS覆盖作对照，染色架置于37℃饱和水汽中（可置于水浴箱中）作用30分钟。
５、 取出载玻片，用去离子水和蒸馏水漂洗后，置铜蓝中，流动PBS冲洗30分钟，15分钟换液一次，取出，吸水纸吸干并充分干燥。
６、 将工作浓度稀释的兔抗鼠荧光抗体加于盖玻片的两个图片上，置37℃水浴作用30分钟。
７、 流动的PBS冲洗30分钟，15分钟换液一次，自然干燥。
８、 镜检
凡组织胞浆内出现兰绿色荧光或荧光颗粒而细胞核无荧光的判为阳性，否则为阴性。
Ⅲ、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验
一、 目的
了解和HA和HI试验并用于诊断ND
二、 实验器材
蛋架 镊子 滴管 10ml试管 微量血凝板 磨平滴管 生理盐水 振荡器 大平皿 1ml吸管 试管架 碘酒棉球 1％鸡红血球 NDV阳性抗血清 搪瓷盘 疑似ND病料接种致死的鸡胚（见实验I）
三、 实验步骤
（一） HA、HI试验
１、 无菌操作，收获鸡胚尿囊腔液。
２、 作HA试验，测出血凝价。
３、 作HI试验，测出血凝抑制价。
４、 观察鸡胚病变，并做记录。
HA试验操作方法表解如下：
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀释倍数 1：10 2：10 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 对照
试 生理盐水
1：5稀释尿囊液
液 0。5％鸡红血球 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
0。5
0。5 0。5
弃 0。5
0。5
混匀；置室温20…30分钟观察结果
结果举例 # # # # # # ＋＋
表1所 示HA价为1：320
表2 HA…微量法（单位：滴）
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
稀释倍数 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 1：128 1：256 1：512 1：1024 1：2048 对照
生理盐水 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
尿囊原液 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0。5％鸡红血球 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
混匀；置室温20…30分钟；观察结果
结果举例 # # # # # # # # # # # #
表2所示HA价为1：256
表3 HI…试管法（单位：ml）
试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
稀释倍数 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 对照
尿囊液 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0。5 0