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实验室手册-第4部分

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4 、溶液应灌装在硬质耐热的玻璃容器内,不要灌装得太满,一般灌至容器的1/2~3/4容积。
5 、不允许将不同类型不同消毒要求的物品放在一起消毒。
6 、每周将安全阀开放数次,这样可以保证安全阀处于良好的灵活状态。
7 、压力表使用日久后会使读不准确,应检修或换上新表。
8 、平时注意消毒器的清洁干燥,可以延长使用年限。
9 、消毒过程中操作者最好不要离开现场,若要离开,一定要交待他人代为看管。
10 、不同物品消毒所需时间、温度与压力:
消毒物类      消毒所需保温       蒸汽压力       表 压     饱和蒸汽相 
              时间(分钟)      (公斤/厘米)(碳/英寸)   对温度( )   
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橡胶类        15                1。05 ?1。1        15?16         121    
敷料类      30?45               1。05?1。4         15?20       121?126     
器皿类        15               1。05?1。4          15?20       121?126
器械类        10               1。05?1。4          15?20       121?126  
瓶装溶液类  20?40               1。00?1。4          15?20      121?126  
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三、 其实各类仪器使用前请详细阅读使用说明书,这里不在一一介绍。




                第三部分  实验室常规试验程序
第一章 组织培养及常用溶液的配制
第一节 鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸭胚成纤维细胞(DEF)培养
一、 材料
9?10日龄鸡胚  13?14日龄鸭胚   眼科剪、 镊、外科镊 、巴氏吸管 、蛋架、灭菌平皿   25ml小三角瓶  Hanks'液  0。25%胰酶液  Versene液  灭菌纱布、玻璃漏斗、0。1% 结晶柠檬酸(0。1M)或0。4%台盼兰;血球计数板、60ML培养瓶或60ML培养皿、灭菌盖玻片、营养液。        
二 方法(CEF为例)
鸡胚 理:取9?10日龄鸡胚直  于蛋架,在气室部用于5%碘酊棉 消毒,再用洒精棉 脱色,用外科镊击破蛋壳用眼科镊取出胚体放于平皿内,去喙瓜眼和内脏,用Hank's液洗两次,用弯头眼科剪剪胚剪成1…2mm的碎块,加Hank’s液20ml;略加摇振,静置使组织块下沉,将混有红血球及碎片的上悬液吸去,重复洗2—3次,直至上悬液不混浊为止。
2、 消化:将0。25%胰蛋白酶溶液用5、6%NaHCO2滴定至PH7、6—7、8,加热至37度,按组织块量3—5倍加于装有鸡胚碎块的三角瓶中,每个鸡胚约需胰酶5ml,30分钟取出,静置1—2分钟,吸去胰液,再加HanK’s液20ml,轻轻摇动后吸去,如此反复两三次,目的是洗去残余的胰酶。第三次加入营养液,每胚3ml左右,用粗口吸管吹吸数次,使细胞脱落分散。静置1—2分钟,候组织下沉后,细心将细胞悬液吸出,另置一只25ml三角瓶,如此反复数次,使细胞尽量自组织块脱落,将多次取得的悬液合并一处,纱布过滤悬液。必须注意每次吹吸一般6—7次为宜 ,太多则细胞受损,消化时间要灵活掌握,不足细胞不易掊落,太久则细胞破碎。
在消化过程中,摇动时组织不易下沉即立即停止,消化后如组织粘连如涕,证明消化过度。
二、 细胞计数:
取细胞悬液0。1(100ul)置盛有0。9ml10。4%台盼蓝的试管中混合;用血球计数板计数。
计算方法:    
                    4大方格细胞数
每ml细胞数=——————————————X10(5)
                      4
               5中格细胞数
或每ml细胞数=——————————X10(4)
三:接种
以营养液配成每ml10(6)细胞(最终稀释度)接种链霉素瓶(1ml)、60ml瓶(8—10ml),100mm  dish(10ml),60mm  dish(4ml),37度孵育48小进后形成单层,接种病毒或作次代培养。
四、CEF单层可供作病毒TCID50LD50等指数的测定;空斑计数病毒中和试验等。

第二节 溶液配方
一、PBS

1、无钙镁PBS
                  50X                   (Less NaCl)
1000ml                双蒸水
10g                   KCl
  60g                KH2PO4
                         60g                Na2HPO4(Na2PO4。12H2O 151g)
溶后分装20ml管,…20 保存
20ml    PBS     base   50X
8g      NaCl
0。3ml    0。5%酚红
980ml    双蒸水              15P    11分钟
2、NaCl       8。0g
   KCl        0。2g
   CaCl2      0。1g
   MgCl2      0。1g
   Na2HPO4   1。15g(Na2HPO4。12H2O ;   2。92g)
   KH2PO4     0。2g
双蒸水至100ml; 过滤除菌,50保存。
3、 分别配制A、B、C原液
A液: NaCl         80。0g
       KCl          2。0g
       KH2PO4      2。0g
       Na2HPO4。2H2O      14。4g(Na2HPO4。12H2O   29。0g)
 双蒸水至800ml
B液:CaCL2      0。5g
      双蒸水     500ml
C液:MgCl2      0。5g
      双蒸水     500ml 
以上三液分别 10P10’高压蒸气灭菌,冷却后
A                   80V
B                   100V
C                   100V
H2O                720V
无菌混合
注意:
   各化学药品的结晶水重量是否扣除!
二Hank’s  Solution
   分别配制 A、B原液
A液:NaCL        160。0
      KCl  8。0   加入800ml双蒸水     
MgSO4。7H2O
MgCl2。6H2O   2。0
      CaCl2       2。8(溶于10ml双蒸水)
双蒸水加至 1000ml                                  
B液:Na2HPO4。12H2O      3。04g
      KH2PO4。2H2O        1。2g      800ml双蒸水
      Glucose               20。0g
0。4%酚红液100ml
双蒸水至1000ml,2ml氯仿防腐,4保存。
A    1V   10P   10min   灭菌
B  1V  10P  10min  灭菌
双蒸水  18V  10P  10min  灭菌
1…4保存,可用1个月。
用5。6%NaHCO3(10P  10min  灭菌)或3。5%,调PH至7。2—7。6(加NaHCO3后须立即使用)。
三、0。4%酚红液。         
 称酚红0。4g→置乳钵滴加0。1N  NaOH(总量11。2g/ml)并不断研磨→所有颗粒全部溶解→100ml量瓶,将已溶后的吸入,用双蒸水洗钵数次,倒入→加双蒸水至100ml摇匀,4℃保存。

四、 Versene液
乙二胺四乙酸二钠(Versene)  0。2克
NaCL                           8。0克
KCL                            0。2克
NaH2PO4                        1。15克(NaH2PO412H2O=2。9)
KH2PO4                          0。2克
双蒸水至1000ml;10P’;10’灭菌;4℃保存;可用3个月。
五、 胰酶液Tryptase
一般配成0。25%
取0。25克溶于100mlHank’s滤过除菌;分装小瓶。…20℃保存。用前融化加入青链霉素100单位/ml并用5。6%NaHCO3滴定至PH7。4…7。6
注意:
1. 为避免消化细胞成团,可配无钙胰酶液.
2. 胰酶威无臭无味的白色粉末,应密封保存,阴暗处防潮解,可分装小瓶保存.
3. 胰酶液的浓度随其活力和消化细胞的来源和种类而定.一般消化配组织用0。1%。
六。碳酸氢钠液
取NaHCO35。6克溶于100ml双蒸水中;使完全溶解后;经滤纸过滤后;分装于瓶中(5ml或2ml)10P;10’灭菌。塞紧胶塞;贴上标签;注明批号日期;4度保存备用。(在4度应为透明液;不得有沉淀)。每瓶开启后使用不得超过2次。
七。0。5%乳蛋白水解叶(LAH)
取5克乳蛋白水解物溶于100mlHank’s液中;根据需要分装50…100ml瓶;立即10P;20’灭菌;4度保存备用;用前;用5。6% NaHCO3滴定PH7。4…7。5。
注:乳蛋白水解物极易潮解;平时必须将瓶塞紧;最好储存于干燥器中;乳蛋白水解物含有丰富的营养成分。0。5%乳蛋白水解物溶液加入适量抗生素和血清;即可用于一般的细胞培养。
(一)。CEF培养
0。5%LAH
CS          5%
Pen          100unit
Str           100ug/ml
5。6% NaHCO3调PH至7。2…7。4
(二)PK细胞培养
0。5%LAH       89。5%
CS             10%
Pen/Str         100unit/100ug/ml
八。Earle’s液
甲液:NaCL          68g
KCL            4g
        NaH2PO4                     1。4g
        葡萄糖          10g
双蒸水至500ml;溶解后加氯仿1ml防腐
乙液:CaCL2              2。0g
     MgCL2              1。7g 
0。4%酚红50ml
双蒸水加至500ml;0…4度保存备用;按比例配成Earle’s液。
 甲     1V       10P   10’灭菌
 乙     1V       10P   10’灭菌
 双蒸水 10V      10P   10’灭菌
4度保存备用;用前用5。6% NaHCO3调PH至7。4…7。5
九。抗菌素溶液(Pen/Str)
用灭菌双蒸水配制每毫升含
Pen(青霉素)10;000units
Str(链霉素)10;000ug
分装小瓶;…20度保存。一般培养液加这种Pen/Str%;最终浓度为100unit/ml。
十、199—F10生长液
199         5。49g(4。95g)
     F10         4。9g
     NaHCO3     1。7g
     S。P           1ml(10万U/ml)
     BFS          40ml
     DDW         至1000 ml
过滤后分装备用。
199…F10维持液:BFS仅用10ml;余者同上
  
              第三节   配制溶液的注意事项
1使用化学药品为A。R。级;标签清楚;最好组织培养专用;防止使用和保存过程中的混淆和污染。
2。配制溶液的用具;需经严格洗刷和消毒;其配制过程尽量在无菌操作下进行。
3。称量药品应力求精确。配制溶液应有详细记录以及消毒,保存;分装和使用情况。
4。配制的每批溶液;需经试用后;方可大量使用。因此需提前配制溶液。溶液保存有一定期限;保存时应经常检查;发现可疑现象和过期;不得使用。
5。注意节约;计划用多少就配多少。
  第二章  淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制
第一节 融合程序
融合方法: 
1、 将108 脾细胞与2—5x107 SP2/0细胞混合于1支50ml融合管中,加入30mlDMEM基础液;
2、 1000r/m离心5分钟;
3、 吸净全部培养液;
4、 在手掌上轻击离心管底部以打碎细胞积块,置400C水浴中预热;
5、 用1ml吸管在45秒内加预热至370C的50%PEG(PH8。0)1ml,边加边搅;
6、 用1ml吸管在90秒内加20—30ml
7、20—37℃静置10分钟;
7、 1000r/m5分钟;
8、 弃尽上清,轻击离心管底以分散细胞积块,重新悬浮于80—100mlHAT培养基中;
9、 按比例加入107  —2X77  腹腔细胞(约2只小鼠);
10、 分装96孔细胞培养板,每孔0。10__0。15ml;24孔板,每孔1。0__1。5ml;
11、 7。5%CO2;37℃孵箱里培养;
12、 5天后HAT培养基换出1/2培养液;
13、 7__10天后用HT培养基换出HAT;
14、 经常观察杂交瘤细胞生长情况;待长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
15、 其它详细资料请参阅刘秀梵教授编。

第二节 溶液配方
一、 基础培养液:
1、老配方      DMEM          13。37g+1000ml双蒸水使之溶解
               丙铜酸钠         0。11g
               碳酸氢钠          3。6g
                pen/str           20万/2   
0. 22u过滤,分装,4℃保存(不超过1个月)
2、新配方       DMEM基础液:
                四蒸水           980ml        NaHCO3       3。7g
                DME(Giboo)      13。37g     S。P(100X)10ml(本实验室用1支庆大霉素)
 1NHCl调试PH至7。2_7。4(本实验室用1NnaOH调至7。2_7。4);过滤除菌;分装后4℃保存。
3、 DMEM完全培养基:
     30mlDMEM基础液中加15…20ml BFS,1mlL…G(100X)即为完全培养基。
4、 HT培养基
   100mlDMEM完全培养基中加入100X HT   1ml即成,或按下列配方直接配制:
            四蒸水                980ml
            DME(Giboo)          13。37g     L。G(100X)    10ml
            HT(100X)             10ml      BFS(NCS)    150_200ml
            NaHCO3              3。7g        S。P(100X)    100ml
用1NHCl调至7。2_7。4; 过滤除菌;分装后4℃保存。
二、 100Xaminopterin(4x10(…5)
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